RIP技術(shù)(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀),是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。分析與目的蛋白結(jié)合的RNA。運(yùn)用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來,然后經(jīng)過分離純化就可以對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行分析;即用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白,防止非特異性的RNA的結(jié)合,免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來,結(jié)合的RNA序列可通過microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定。是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過程的有力工具,能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。
1. 細(xì)胞裂解液獲取
2. 磁珠的準(zhǔn)備
3. RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀
4. RNA純化
1. 貼壁細(xì)胞:用胰酶將細(xì)胞消化下來,或用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下來,將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘,棄上清留細(xì)胞沉淀,干冰運(yùn)輸。
2. 懸浮細(xì)胞:將培養(yǎng)液1000轉(zhuǎn)/分,離心10min。棄上清留細(xì)胞沉淀,干冰運(yùn)輸。
3. 細(xì)胞上清:3000轉(zhuǎn)/分,離心15min取上清,上清立即用于實(shí)驗(yàn),或分裝后于-20℃或-80℃保存。避免反復(fù)凍融。