常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由于文庫(kù)PCR擴(kuò)增偏好性，所有序列并不會(huì)被同比例放大，因而造成測(cè)序定量結(jié)果與樣本中轉(zhuǎn)錄本的原始豐度不一致，導(dǎo)致差異基因篩選不準(zhǔn)確（圖1）。這也是造成qPCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果不一致的主要原因。聯(lián)川生物推出的絕對(duì)定量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，采用主流UMI標(biāo)記技術(shù)[1,2,3]，通過(guò)UMI標(biāo)記每一條序列，可以消除PCR擴(kuò)增偏好對(duì)定量的干擾，真實(shí)反映樣本中轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度（圖2）。在文庫(kù)PCR擴(kuò)增和測(cè)序過(guò)程中難免會(huì)引入錯(cuò)誤的堿基，具有相同UMI標(biāo)記的序列可以基于多序列比對(duì)來(lái)糾正PCR擴(kuò)增和測(cè)序過(guò)程中引入的錯(cuò)誤，確保獲得轉(zhuǎn)錄本的真實(shí)序列（見(jiàn)圖3）。
圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的duplication顯著干擾準(zhǔn)確定量
圖2 UMI標(biāo)記技術(shù)消除duplication干擾
圖3 UMI標(biāo)記技術(shù)糾正序列錯(cuò)誤
真實(shí)定量：采用UMI標(biāo)記技術(shù)，每一條序列都被唯一標(biāo)識(shí)，保留序列真重復(fù)，去除PCR擴(kuò)增假重復(fù)，真實(shí)反映樣本中轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度。真實(shí)序列：具有相同UMI標(biāo)記的序列可以基于多序列比對(duì)來(lái)糾正PCR擴(kuò)增和測(cè)序過(guò)程中引入的錯(cuò)誤, 確保獲得轉(zhuǎn)錄本的真實(shí)序列。
細(xì)胞，組織，全血，血清，血漿，總RNA等
建議總RNA起始量：2 μg，最低1 μg，濃度≥50 ng/μL
參考文獻(xiàn)
1.Shiroguchi K, et al. Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jan 24;109(4):1347-52.2.Kivioja T, et al. Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers. Nat Methods. 2011, 9(1):72-43.Saiful Islam, et al. Quantitative single-cell RNA-seq with unique molecular identifiers. Nature Methods 2014, 11:163-166.
A1：主要有這6個(gè)原因：1）文庫(kù)PCR擴(kuò)增偏好，2）你驗(yàn)證的分子不對(duì)，3）用不同批次的樣品做驗(yàn)證，4）用不同的樣本類型做驗(yàn)證，5）拿低表達(dá)或差異不顯著的基因做驗(yàn)證，6）樣本比對(duì)關(guān)系搞反。查看詳情
A2：使用絕對(duì)定量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，助您篩選出真實(shí)的差異表達(dá)基因，讓你的時(shí)間不再花在假陽(yáng)性結(jié)果的驗(yàn)證上，更快地開(kāi)展下游功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，快人一步地發(fā)表研究成果。
這項(xiàng)工作討論了如何最小化PCR擴(kuò)增偏好性（就是Duplication）對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)，特別是低拷貝序列，定量分析的干擾。研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出了一種稱為Digital RNA sequencing的方法：序列在反轉(zhuǎn)錄后，加入大量的標(biāo)簽（barcode），幾乎每個(gè)cDNA都被唯一的barcode標(biāo)記，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)（見(jiàn)下圖）。由于序列是被barcode唯一標(biāo)記的，計(jì)算序列拷貝數(shù)時(shí)，不再直接統(tǒng)計(jì)同一種reads的數(shù)量，而是統(tǒng)計(jì)每種reads有多少個(gè)unique的barcode。而具有相同barcode的同一種reads，無(wú)論有多少拷貝數(shù)，都只計(jì)作一個(gè)拷貝，即來(lái)自PCR擴(kuò)增的假重復(fù)（Duplication）被有效去除。
可以簡(jiǎn)單地認(rèn)為，在樣本中cDNA1有3個(gè)拷貝，cDNA2有2個(gè)拷貝，比例為3:2，然后用大量不同的barcode標(biāo)記這5條序列，每條序列都被unique的barcode標(biāo)記，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增完成文庫(kù)制備。由于Duplication的存在，在沒(méi)有barcode標(biāo)記的情況下，cDNA1經(jīng)擴(kuò)增變成了9個(gè)拷貝，cDNA2變成了12個(gè)拷貝，比例變成了3:4，而兩者原始的比例是3:2；而標(biāo)記了barcode的cDNA1和cDNA2，合并具有相同barcode的同種序列后，cDNA1和cDNA2仍保持原始的拷貝數(shù)和比例，此種方案下測(cè)序定量結(jié)果準(zhǔn)確反映了樣本中序列的真實(shí)豐度和比例。
圖 標(biāo)簽標(biāo)記序列法去除Duplication的原理
Shiroguchi K, et al. Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jan 24;109(4):1347-52.
差異基因聚類分析熱圖
用于判斷基因在不同實(shí)驗(yàn)條件下調(diào)控模式的聚類模式根據(jù)樣品基因表達(dá)譜的相近程度，將基因進(jìn)行聚類分析，直觀地展示基因在不同樣品（或是不同處理）中的表達(dá)情況，由此獲取生物學(xué)相關(guān)信息。
差異顯著差異表達(dá)基因上下調(diào)頻數(shù)統(tǒng)計(jì)柱狀圖用于統(tǒng)計(jì)差異基因數(shù)目
差異表達(dá)基因分析火山圖
用于了解差異表達(dá)基因的整體分布情況。以log2(foldchange)為橫坐標(biāo)，-log10(pvalue)為縱坐標(biāo)，對(duì)差異表達(dá)分析中所有的基因繪制火山圖。其中橫坐標(biāo)代表基因在不同樣本中差異表達(dá)倍數(shù)變化；縱坐標(biāo)代表基因表達(dá)量變化差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
差異基因GO富集柱狀圖
用于反映在生物過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)富集的GO term上差異基因的個(gè)數(shù)分布情況。
GO功能富集散點(diǎn)圖
用于展示GO term的富集情況。Rich factor表示位于該GO的差異基因個(gè)數(shù)/位于該GO的總基因數(shù)，Rich factor越大，GO富集程度越高。
皮爾森相關(guān)系數(shù)圖
用于反映生物學(xué)重復(fù)、樣本相關(guān)性，確保后續(xù)的差異基因分析得到更可靠的結(jié)果。
可變剪切統(tǒng)計(jì)圖
對(duì)該物種及其相應(yīng)的測(cè)序樣品進(jìn)行可變剪切事件的分類及統(tǒng)計(jì)。
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