背景簡介
擴增子測序是對特定長度的PCR產物或捕獲的片段進行測序，分析序列中的變異。16S/ITS等擴增子測序即通過提取環(huán)境樣品的DNA，選擇合適的通用引物擴 16S/ITS的目標區(qū)域，通過檢測目標區(qū)域的序列變異和豐度，以研究環(huán)境微生物多樣性及群落組成差異。16S rDNA為編碼原/真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列。ITS分為兩個區(qū)域：ITS1位于真核生物rDNA序列18S和5.8S之間，ITS2位于5.8S和28S之間。
技術優(yōu)勢
鑒定到“種”：菌群多樣性鑒定率先精細到“種”，分類更明確。
數據庫豐富：基于最新版Greengene和自建數據庫，和自主開發(fā)的分析注釋工具，最多可鑒定4414個種，
覆蓋2106個屬，可鑒定菌種持續(xù)更新中。
低成本：相比于傳統(tǒng)菌落鑒定，分析通量更高，檢測成本更低。
技術路線
分析內容
樣本類型
菌體，DNA等
建議總DNA起始量：>20ng(較純DNA，無宿主及其他雜質污染)
近期用戶文章
1. Gao, S., et al.（2015）Tolerance response to in situ ammonia stress in a pilot-scale anaerobic digestion reactor for alleviating ammonia inhibition. Bioresource Technology 198:372.
2. Gou, H., et al. (2016) Assessment of microbial communities in PM1 and PM10 of Urumqi during winter." Environmental Pollution 214: 202-210.
3. Huang, Y., B. Yang, and W. Li. (2016) Defining the normal core microbiome of conjunctival microbial communities. Clinical Microbiology & Infection 22.7: 643.e7-643.e12.
4. Lv, Long‐Xian, et al. (2016) Alterations and correlations of the gut microbiome, metabolism and immunity in patients with primary biliary cirrhosis. Environmental Microbiology 18.7:2272.
5. Hu, Jinxiang, et al. (2016) Pepino (Solanum muricatum) planting increased diversity and abundance of bacterial communities in karst area. Scientific Reports 6:21938.
Q1：什么是嵌合體？
A：嵌合體的形成：在PCR時，當不完全的DNA鏈與不同的模板退火時，嵌合擴增子形成，并引發(fā)衍生自兩種不同生物學序列的新模板的合成。嵌合體在正常生物體中是不存在的。參考文獻：Robert C. Edgar, UCHIME2: improved chimera prediction for amplicon sequencing，2016.
Q2：PCoA分析有多種不同計算方法及結果，甚至還有其他不同的分析方法來計算樣本間距離，我要選哪一種為最終的展示結果呢？
A：PCoA分析和其他不同的分析方法都是用來展示組間差異和組內相似性的結果，不同的計算方法相當于是不同的角度來看這個結果，老師只要選擇與實驗設計最合適的結果進行展示說明即可。
Q3：α多樣性指數之間有什么區(qū)別嗎？
A：observed_species、chao1指數用來描述物種的數目；而shannon、simpson指數則是用來描述物種多樣性的，這兩個指數不僅考慮了物種的數目，還考慮了物種的豐度，也就是所有物種的均勻度。如果每一個體都屬于不同的種，多樣性指數就最大；如果每一個體都屬于同一種，則其多樣性指數就最小。如果一個樣品物種數目很多，但均勻度很差，即某個物種豐度很高，但另一物種豐度很低，就會造成observed_species、chao1指數高而shannon、simpson指數不高的現象。簡單說： observed_species、chao1指數高，說明樣品物種數目多；shannon、simpson指數高，說明物種豐度以及均勻度都很高。
Q4：微生物群落研究方法的區(qū)別？
A：16S rDNA測序：由于研究對象只為細菌的16S rDNA，因此16S測序技術更多只用于研究群落物種信息，也就是利用OTU物種分類、α和β多樣性分析等手段解答群落有什么物種，物種關系是什么等問題。因此，這種技術更多地只能了解到環(huán)境對微生物的組成有何影響，更偏向于單向關系研究。
宏基因組測序：宏基因組的研究對象為群落所有DNA，因此研究范圍更廣。理論上不單只可以了解群落的組成和多樣性等物種信息，同時，利用基因的注釋信息，還可以挖掘群落的核心功能和通路信息，在基因組層面了解這個群落到底有什么物種，這些物種能夠發(fā)揮什么功能。只有了解群落功能，才能知道它們對環(huán)境有什么影響，這有利于進行微生物與環(huán)境的雙向研究。
宏轉錄組測序：宏轉錄組以mRNA為研究對象，同樣的通過數據組裝和比對，能同時挖掘物種信息，基因功能信息，發(fā)現新基因，這與宏基因組的作用沒太大差別。它的特點在于，因為是轉錄組信息，因此在進行基因研究的時候，可以關注到基因表達情況，從而更深入地了解基因如何被調控，基因表達如何應答環(huán)境變化等細節(jié)問題，在功能研究上更為細致。
定義正常人類眼結膜微生物群落的 "core microbiome"
研究背景
眼部細菌感染是很常見的，但運用傳統(tǒng)培養(yǎng)與分子生物學方法鑒定結膜微生物群具有明顯的局限性。而宏基因組研究可以彌補這些方法的缺陷。
研究結果
黃鈺森組運用Illumina高通量測序技術（MiSeq 測序平臺）對結膜擦拭樣本中所有細菌的16S rDNA V3-V4高變區(qū)進行測序。從測序數據中獲得操作分類單元（OTUs）。接著，進行微生物分類、豐度、 α多樣性等生物信息學分析。從31個結膜樣本中得到840373個高質量測序reads。不同種類的OTU數量從159到2042，顯示出很高的微生物多樣性。這些細菌菌落可分為25個門和526個不同的屬。在屬的水平，棒狀桿菌屬（28.22%）、假單胞菌屬（26.75%）、葡萄球菌屬（5.28%）、不動桿菌屬（4.74%）、鏈球菌屬（2.85%）、 Millisia（2.16%）、厭氧球菌屬（1.86%）、大芬戈爾德菌屬（1.68%）、西蒙斯氏菌屬（1.48%）、韋榮氏球菌屬（1.00%）占整個微生物群落的76%以上，可能代表了正常結膜微生物群的“core genera” 。
圖 眼結膜微生物群落分類
參考文獻
Huang YS, et al. (2016) Defining the normal "core microbiome" of conjunctival microbial communities. Clinical Microbiology and Infection. doi:10.1016/j.cmi.2016.04.008.
樣品豐度柱狀圖根據物種豐度表和物種注釋表，默認選取豐度最高的20個物種分類，進行相對豐度計算，獲得相對豐度文件，繪制樣品豐度比較的柱狀圖，該柱狀圖以堆疊柱狀圖 (stacked bar chart)形式展現，便于更直觀地進行樣品豐度的比較。在各個層級中， 可以直觀的看到優(yōu)勢菌種的表達情況及在各個不同處理中的變化趨勢。當然， 若是有關注稀有菌群的表達情況時，也可以展現所有物種分類。
物種分類熱圖（taxa heatmap）根據樣品相對豐度表，將各分類水平相對豐度最高20個的群落組成數據根據分類 單元的豐度分布或樣本間的相似程度加以聚類，根據聚類結果對分類單元和樣本 分別排序，并通過熱圖加以呈現。通過聚類，可以將高豐度和低豐度的分類單元 加以區(qū)分，并以顏色梯度及相似程度來反映多個樣品在各分類水平上組成的相似 性和差異性。
物種注釋結果KRONA展示使用Krona軟件動態(tài)可視化展示單樣品在不同分類水平注釋結果，通過調節(jié)不同的參數來調整展示的圖片。如果項目比較關注某一個物種，可通過在Search欄中輸入關注物種的名稱，可快速定位到關注物種在樣品中的表達情況。通過點擊左側欄中的樣品名，來展示該樣品的物種注釋表達情況。
RDA分析RDA分析實際上是約束化的主成分分析（PCA），它的優(yōu)點是考慮了環(huán)境因子（如土壤研究中的PH值，酸堿度，疾病研究中臨床理化因子等）對樣本的影響， 可同時反映樣本，環(huán)境因子和物種三者或兩兩之間的關系。
LEfSe分析LEfSe分析主要目的是進行兩組或多組之間的比較，找到不同組間在豐度上有顯著性差異的物種（biomarker）。
Spearman關聯(lián)分析主要目的是觀察微生物間（或OTU）的相互作用，通過斯皮爾曼（Spearman）關聯(lián)系數計算等方法，找尋微生物在不同環(huán)境下的可能的相互“協(xié)作”或“競爭” 的關系。
