基因組重測(cè)序是對(duì)已知基因組序列的物種進(jìn)行全基因組范圍的測(cè)序，并在此基礎(chǔ)上對(duì)個(gè)體或群體進(jìn)行差異性（SNP、InDel和SV等）分析?；诨蚪M重測(cè)序技術(shù)，可以快速進(jìn)行資源普查篩選，尋找到大量遺傳變異，實(shí)現(xiàn)遺傳進(jìn)化分析及重要性狀候選基因的預(yù)測(cè)。隨著測(cè)序成本降低以及擁有參考基因組序列物種增多，基因組重測(cè)序成為研究遺傳育種和群體進(jìn)化的有效方法。
在全基因組水平檢測(cè)與表型關(guān)聯(lián)的高頻、低頻、甚至是罕見(jiàn)的點(diǎn)突變及結(jié)構(gòu)變異信息
對(duì)于個(gè)體樣本，可獲得全面的基因組突變譜信息
對(duì)于群體樣本，可進(jìn)一步研究物種的進(jìn)化歷史、環(huán)境適應(yīng)性、自然選擇和性狀定位
技術(shù)路線
細(xì)胞，組織，全血，總DNA等
建議總DNA起始量：5 μg，最低0.5 μg，濃度≥300 ng/μL（Qubit定量）
A：重測(cè)序一般可以檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入缺失（InDel）、拷貝數(shù)變異（CNV）、染色體結(jié)構(gòu)變異（SV）等。
A：測(cè)序深度根據(jù)研究目的、樣本量及合作伙伴的預(yù)期而定。30×測(cè)序深度即可檢測(cè)絕大部分SNV，但如果客戶的研究目的是尋找癌組織中較大的結(jié)構(gòu)變異、少數(shù)腫瘤細(xì)胞攜帶的豐度較低的突變，建議測(cè)序深度（一般）至少50×以上；群體重測(cè)序可以使用較低深度測(cè)序（～10×），用群體分析策略尋找相關(guān)變異。
A：FFPE樣本提取的DNA多數(shù)存在降解的情況，基因組呈現(xiàn)片段化，CNV/SV等結(jié)構(gòu)性變異檢出的假陽(yáng)性率較高，無(wú)法體現(xiàn)全基因組測(cè)序在結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)方面的優(yōu)勢(shì)，且通過(guò)增加測(cè)序深度提高變異檢出準(zhǔn)確性的成本太高。
A：全外顯子組測(cè)序捕獲基因組的外顯子區(qū)域，其基因組信息約占基因組大小的1.5%；全基因組測(cè)序?qū)τ谌蚪M層面來(lái)說(shuō)，變異信息更全面，沒(méi)有止步于編碼區(qū)，而是向整個(gè)非編碼區(qū)擴(kuò)展，性價(jià)比更高，平均數(shù)據(jù)單價(jià)較全外顯子組測(cè)序便宜了5倍以上。近些年非編碼區(qū)突變的研究越來(lái)越多，其可與多種癌癥在內(nèi)的復(fù)雜疾病發(fā)生相關(guān)。
全基因組測(cè)序鑒定卵巢癌化療抗性特征
研究背景
過(guò)去的30年間，高級(jí)別漿液性卵巢癌（High-grade serous ovarian cancer, HGSC）患者的存活情況幾乎沒(méi)有改善，標(biāo)準(zhǔn)治療的方法未見(jiàn)比以鉑類為主要成分的聯(lián)合化療方法效果有提高。本文研究化療選擇下HGSC基因組進(jìn)化，以期發(fā)現(xiàn)如何克服化療抗性產(chǎn)生的治療方法。
方法流程
取材：92個(gè)HGSC患者原發(fā)實(shí)體瘤、腹水樣本或尸檢樣本共114個(gè)樣本及正常對(duì)照
測(cè)序: 1. HiSeq 2000，PE 100 bp ; 2. WGS：Tumor 52×、Normal 40× ; 3. 轉(zhuǎn)錄、甲基化、miRNA支撐WGS數(shù)據(jù)
分析: 1. 與參考基因組GRCh37進(jìn)行比對(duì) 2. 檢測(cè)somatic mutation 3. 高頻突變基因篩選 4. 突變特征分析 5. 融合基因檢測(cè) 6. 分子分型
80個(gè)實(shí)體瘤和12個(gè)腹水樣本共找到36,561個(gè)SVs，其中每個(gè)樣本SV數(shù)目在48~1,064個(gè)，所有樣本TP53突變普遍存在。另有超過(guò)一半的原發(fā)瘤樣本，同源重組修復(fù)功能受損或者BRCA甲基化。多個(gè)樣本抑癌基因RB1、NF1、RAD51B、PTEN 和化療抗性基因CCNE1 發(fā)生突變，且CCNE1 基因突變與同源重組通路不同。
發(fā)現(xiàn)樣本以BRCA signatrue和Age signatrue為主。如果樣本只是產(chǎn)生BRCA 基因突變，那么進(jìn)行化療是敏感的，但一旦樣本出現(xiàn)CCNE1 基因突變，那么個(gè)體進(jìn)行化療比較難治療或者會(huì)產(chǎn)生抗性。并且結(jié)合臨床研究，出現(xiàn)CCNE1 突變的患者預(yù)后比較差。
患者化療后其編碼區(qū)和非編碼區(qū)SNV/InDel數(shù)量增多，且化療后產(chǎn)生治療抗性的患者存在BRCA1啟動(dòng)子去甲基化、BRCA1 / BRCA2 功能恢復(fù)性突變、SLC25A40-ABCB1基因融合的情況。
研究結(jié)論
通過(guò)對(duì)HGSC患者的成對(duì)樣本進(jìn)行WGS研究，重點(diǎn)關(guān)注前期化療有效且后期化療產(chǎn)生抗性的患病個(gè)體。在產(chǎn)生化療抗性的個(gè)體中頻繁檢測(cè)到CCNE1基因突變，說(shuō)明CCNE1基因突變意味著預(yù)后差。通過(guò)檢測(cè)不同治療階段癌細(xì)胞的變異情況，發(fā)現(xiàn)基因斷裂導(dǎo)致抑癌基因失活是產(chǎn)生化療抗性的重要原因。此外還觀測(cè)到一些分子事件與獲得性抗性相關(guān)，如BRCA1或BRCA2 reversion，BRCA1啟動(dòng)子去甲基化，周期性啟動(dòng)子融合。此項(xiàng)研究揭示了在化療選擇壓力下HGSC患者基因組的異質(zhì)性和適應(yīng)性，在選擇化療方案作為HGSC治療手段時(shí)，需要采用必要的策略避免產(chǎn)生化療抗性。
參考文獻(xiàn)
Patch A M, Christie E L, Etemadmoghadam D, et al. Whole–genome characterization of chemoresistant ovarian cancer[J]. Nature, 2015, 521(7553):489-94.
測(cè)序深度圖利用重復(fù)標(biāo)記后的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行覆蓋度，深度等的統(tǒng)計(jì)。左圖為不同 的測(cè)序深度的堿基比例。橫坐標(biāo)表示測(cè)序深度，縱坐標(biāo)表示測(cè)序深度為x的堿基在所有堿基中的比例；右圖為不同測(cè)序深度上的累積堿基比例，橫 坐標(biāo)表示測(cè)序深度，縱坐標(biāo)表示測(cè)序深度超過(guò)x的堿基在所有堿基中的比例。 比如測(cè)序深度為50X對(duì)應(yīng)的堿基比例約為95%，表示約有95%的堿基其測(cè) 序深度大于50X。
染色體覆蓋深度圖橫坐標(biāo)表示各染色體，縱坐標(biāo)表示平均覆蓋深度。
Reads覆蓋度階梯圖縱坐標(biāo)為測(cè)序深度對(duì)應(yīng)的Reads的覆蓋比例，不同顏色代表不同的測(cè)序深度，圖中 樣本A 93.23%的Reads覆蓋了20X以上，樣本B 94.66%的Reads覆蓋了20X以上。
基因組和外顯子區(qū)域SNP特征圖第1個(gè)柱狀圖中，Hom代表純合，其縱坐標(biāo)代表基因型為純合的SNP數(shù)目；Het代表雜合，其縱坐標(biāo)代表基因型為雜合的SNP數(shù)目, Het rate代表雜合基因型的SNP在所有SNP中的比例。第2個(gè)柱狀圖中，tv代表顛換，其縱坐標(biāo)代表tv的SNP數(shù)目；ts代表轉(zhuǎn)換，其縱坐標(biāo)代表ts的SNP數(shù)目。ts/tv是轉(zhuǎn)換/顛換的比值。
SV circos圖選取測(cè)序質(zhì)量值top20個(gè)SV進(jìn)行了圈圖繪制，圈圖中間弧形連接的片段發(fā)生了染色體結(jié)構(gòu)變異，位置發(fā)生了重排。
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