背景簡介
宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在轉(zhuǎn)錄水平，以特定樣本中微生物群落的全部轉(zhuǎn)錄本為研究對象，分析微生物群落的基因表達(dá)與調(diào)控。宏轉(zhuǎn)錄組測序，避開了微生物的分離培養(yǎng)，為研究人員提供了從整體水平研究特定環(huán)境，特定時(shí)期微生物群落基因組轉(zhuǎn)錄情況以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的高效工具。
技術(shù)優(yōu)勢
樣本處理個(gè)性化：由于微生物樣本組成復(fù)雜，將根據(jù)不同樣本特點(diǎn)，針對性進(jìn)行樣本處理和文庫制備。
數(shù)據(jù)分析優(yōu)化：精選數(shù)據(jù)拼接軟件，最大程度獲取微生物群落基因組轉(zhuǎn)錄信息。
注釋全面：采用最新版數(shù)據(jù)庫，更精確地注釋和分析微生物群落基因表達(dá)信息。
跨組學(xué)分析：從宏基因組到宏轉(zhuǎn)錄組，多個(gè)角度解析微生物群落結(jié)構(gòu)與功能。
技術(shù)路線
分析內(nèi)容
樣本類型
樣本類型：培養(yǎng)的細(xì)菌(≥ 5×106)，組織，環(huán)境樣品，總RNA等
RNA總量：≥ 5 μg，濃度：≥50ng
OD值：260/230≥1.5；260/280≥1.8
完整性（bioanalyzer2100）：RIN值≥7,28S/18S≥0.7，或者峰型銳利，模擬電泳圖無彌散，5S峰顯示正常的樣品
Q1：對于小型動(dòng)物，如果采樣時(shí)不能分離腸道和腸道內(nèi)容物，宿主對宏轉(zhuǎn)錄組的影響很大，這種情況下，需要如何解決？
A：對于這種問題可以從以下兩個(gè)方面進(jìn)行解決:
1.在實(shí)驗(yàn)建庫過程中去除宿主污染（比如宏轉(zhuǎn)錄組中用去polyA法去除宿主mRNA）；
2.另一種更直接的方法是，加大測序數(shù)據(jù)量，通過與宿主基因組比對去除宿主污染，但該方法前提是需要有宿主參考基因組，如果宿主沒有參考基因組，當(dāng)污染很高的情況下，基本上沒有辦法去除宿主污染。
Q2：宏轉(zhuǎn)錄組測序完成后是否需要驗(yàn)證？是用qPCR方法驗(yàn)證嗎？
A：如果是群落水平的驗(yàn)證，qPCR可以作為一個(gè)考慮的方法。但是宏轉(zhuǎn)錄組的微生物含量非常不穩(wěn)定，qPCR不一定具有代表性。最好的辦法是找到基因的菌落歸屬，然后做一些單細(xì)菌克隆驗(yàn)證。
Q3：如果不做宏基因組測序?qū)嶒?yàn)，那是不是也沒有做宏轉(zhuǎn)錄組測序的必要？
A：宏轉(zhuǎn)錄組和宏基因組關(guān)注的點(diǎn)不一樣，宏轉(zhuǎn)錄組在建庫中可能會(huì)去掉一些RNA或者功能分析，但是實(shí)際上宏轉(zhuǎn)錄組相關(guān)的文章很多，因此不需要擔(dān)心這個(gè)問題。
宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析綿羊瘤胃中微生物與甲烷產(chǎn)量的關(guān)系
反芻動(dòng)物是單一且最大的人為溫室氣體甲烷來源的代表。甲烷由反芻動(dòng)物消化道中的產(chǎn)甲烷古菌產(chǎn)生。雖然相同品種的單個(gè)動(dòng)物之間甲烷產(chǎn)量的差異已被觀察到，這種變化的依據(jù)仍有待闡明。為探索這種甲烷產(chǎn)量的機(jī)理，研究人員測定了22只綿羊的甲烷產(chǎn)量，結(jié)果揭示甲烷產(chǎn)量具有可重復(fù)、可量化的特征。宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組測序證實(shí)，甲烷排放量高和低的綿羊都具有類似的產(chǎn)甲烷菌豐度和甲烷生成途徑基因。然而，對于甲烷排放量高的綿羊，產(chǎn)甲烷途徑基因的轉(zhuǎn)錄大幅增加。鑒定出一組瘤胃產(chǎn)甲烷菌，這些產(chǎn)甲烷菌的甲烷生成途徑轉(zhuǎn)錄譜與甲烷產(chǎn)量相關(guān)。上圖為瘤胃產(chǎn)甲烷菌進(jìn)化分析。
參考文獻(xiàn)
W Shi，et al. (2014)Methane yield phenotypes linked to differential gene expression in the sheep rumen microbiome. Genome Research. doi/10.1101/gr.168245.113
樣本物種豐度柱狀圖
根據(jù)物種注釋結(jié)果及豐度統(tǒng)計(jì)，默認(rèn)選取各分類水平（界門綱目科屬種）豐 度最高的20個(gè)物種，進(jìn)行樣品豐度柱狀圖的繪制，該柱狀圖以堆疊柱狀圖 (stacked bar chart)形式展現(xiàn), 便于更直觀地進(jìn)行樣品間物種豐度的比較。 在各個(gè)層級中，可以直觀的看到優(yōu)勢菌種的表達(dá)情況及在各個(gè)不同處理 中的變化趨勢。
KEGG注釋統(tǒng)計(jì)根據(jù)KEGG注釋總表，可以對KEGG注釋的總體情況進(jìn)行Unigene數(shù)目的統(tǒng)計(jì)。
抗生素耐藥基因注釋CARD全稱是Comprehensive Antibiotic Resistance Database，目前該數(shù)據(jù)庫 仍在不斷地更新，該數(shù)據(jù)庫以ARO（Antibiotic Resistance Ontology）為核心對耐藥性數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，以達(dá)到數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)更新的效果。通過對Unigene進(jìn)行對 應(yīng)的抗生素耐藥性注釋，并統(tǒng)計(jì)抗生素耐藥功能的豐度。
eggNOG功能注釋eggNOG是一個(gè)用于同源聚類基因群注釋的專業(yè)數(shù)據(jù)庫，它包括來自原始COG/KOG的功能分類，以基于分類學(xué)的功能注釋。
