以高通量測序?yàn)榇淼默F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的突飛猛進(jìn)，正在對(duì)傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)產(chǎn)生影響，目前已在無創(chuàng)產(chǎn)前篩查、染色體拷貝數(shù)變異篩查、遺傳病致病位點(diǎn)篩查、胚胎植入前診斷等臨床檢驗(yàn)中心應(yīng)用。隨著國家食品藥品監(jiān)督管理局接連批準(zhǔn)基于高通量測序技術(shù)（NGS），以及伴隨診斷標(biāo)準(zhǔn)審批的多基因腫瘤突變聯(lián)合檢測試劑盒，illumina的儀器也在前幾天獲批，NGS已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域不可忽視的重要技術(shù)。
不同于往常的檢測手段，從樣本處理到檢測結(jié)果，NGS存在諸多繁雜的步驟。只有保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，臨床應(yīng)用才能落到實(shí)處。在NGS實(shí)驗(yàn)室的管理體系上不斷優(yōu)化，力求打造管理科學(xué)化，操作規(guī)范化，方法標(biāo)準(zhǔn)化及體系國際化的實(shí)驗(yàn)室，是該行業(yè)大家最關(guān)心的話題。今天我就結(jié)合在工作中踐行的實(shí)際情況，淺談“5M1E”分析法在NGS實(shí)驗(yàn)室管理中的應(yīng)用。
“5M1E”其實(shí)就是對(duì)全面質(zhì)量管理理論中六個(gè)影響產(chǎn)品質(zhì)量的主要因素的簡稱，是指6種分析維度與方法，其中五項(xiàng)的英文是以M開頭，一項(xiàng)是以E開頭，分別為：“5M”：Man（人），Machine（機(jī)），Material（料），Method（法），Measurement（測）；“1E”：Environment（環(huán)）。
一、 人
人員是NGS實(shí)驗(yàn)室管理中最活躍的因素，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的全部活動(dòng)起著主導(dǎo)和支配作用，是決定實(shí)驗(yàn)室檢測質(zhì)量的根本因素。
1、 專業(yè)與能力：因二代測序?qū)嶒?yàn)操作的復(fù)雜性，對(duì)NGS檢驗(yàn)人員的要求不能僅僅停留在簡單進(jìn)行儀器操作這個(gè)層面上。為保證檢驗(yàn)結(jié)果的快速、準(zhǔn)確，檢驗(yàn)人員不但要熟練掌握各種儀器的操作，更要了解可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的全方位因素，檢驗(yàn)人員在技能方面必須有分子生物學(xué)的專業(yè)知識(shí)和技術(shù)能力。
2、 教育與培訓(xùn)：人員的培訓(xùn)在保證檢驗(yàn)質(zhì)量中尤為重要，從事二代測序的檢驗(yàn)人員在上崗前必須先取得臨檢中心《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員培訓(xùn)合格證》和NGS技術(shù)的理論與技能培訓(xùn)。分析人員需要經(jīng)過生物信息學(xué)的培訓(xùn)。
3、 專才到全才：為了讓檢驗(yàn)人員可以在保證質(zhì)量的前提下快速上崗，可以將NGS實(shí)驗(yàn)室崗位進(jìn)行細(xì)分，如收樣、提取、建庫、質(zhì)檢純化、上機(jī)測序等，先按單崗進(jìn)行培訓(xùn)考核上崗，定崗定區(qū)域，等熟練后再進(jìn)行全方位培訓(xùn)，這樣有助于實(shí)驗(yàn)室人員的安排，也有助于檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
二、 機(jī)
這里是指直接或間接用于檢測分析的，對(duì)檢測結(jié)果有影響的儀器設(shè)備及有關(guān)輔助性儀器設(shè)備等，這里包含了測序后數(shù)據(jù)分析軟件。
1、 儀器設(shè)備的校準(zhǔn)與確認(rèn)：對(duì)于檢測設(shè)備，經(jīng)過采購、到貨驗(yàn)收、安裝調(diào)試等過程后，首先在設(shè)備投入使用前進(jìn)行校準(zhǔn)或驗(yàn)證確認(rèn)，確保用于檢測的設(shè)備及其軟件達(dá)到檢測的準(zhǔn)確度和規(guī)范性。當(dāng)校準(zhǔn)報(bào)告給出一組修正因子時(shí)，需要將其校準(zhǔn)因子在實(shí)際中正確運(yùn)用，否則會(huì)有儀器偏差引入。
2、 數(shù)據(jù)分析軟件：這是NGS實(shí)驗(yàn)室特有的環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)室需要用商品試劑配套的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并確認(rèn)使用軟件的版本和數(shù)據(jù)庫的現(xiàn)行有效版本；數(shù)據(jù)需要專業(yè)的生信人員進(jìn)行分析，需要在數(shù)據(jù)預(yù)處理、數(shù)據(jù)比對(duì)、數(shù)據(jù)質(zhì)控、分析判斷等每個(gè)流程進(jìn)行質(zhì)控，確保數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。
3、 儀器的配套使用：需要使用商品試劑申報(bào)時(shí)的配套儀器型號(hào)，如燃石人EGFR/ALK/BRAF/KRAS 基因突變聯(lián)合檢測試劑盒（可逆末端終止測序法）受理號(hào)為CSZ1700157，配套儀器為Illumina 公司生產(chǎn)的MiSeqDx，雖然Illumina公司有MiSeq、MiniSeq、NextSeq500等不同型號(hào)的測序儀，但在檢測過程中必須選用MiSeqDx型號(hào)的儀器，否則儀器之間的差異會(huì)影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
4、 設(shè)備的標(biāo)識(shí)：設(shè)備標(biāo)識(shí)是設(shè)備管理過程中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，設(shè)備要有一個(gè)唯一性編號(hào)的標(biāo)識(shí)，這個(gè)編號(hào)是唯一性的，即使是同樣型號(hào)的儀器也不允許重復(fù)，只有這樣才能做到檢測數(shù)據(jù)的溯源性要求。還有設(shè)備的運(yùn)行、維修、暫停等狀態(tài)也需要做好標(biāo)識(shí)，防止設(shè)備的非預(yù)期使用影響到檢測結(jié)果。
5、 設(shè)備的維護(hù)和保養(yǎng)：設(shè)備要定期做好維護(hù)和保養(yǎng)，一般校準(zhǔn)和驗(yàn)證的周期為1年，中間可以采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或同型號(hào)設(shè)備進(jìn)行比對(duì)，確保設(shè)備的性能，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。如設(shè)備有大的關(guān)鍵零件的維修更換、精密儀器的位置搬動(dòng)等，需要對(duì)設(shè)備的性能重新進(jìn)行驗(yàn)證確認(rèn)。如測序儀等設(shè)備對(duì)外界環(huán)境有溫濕度要求的，要確保環(huán)境符合要求，并做好監(jiān)控和記錄，否則外界環(huán)境對(duì)檢測結(jié)果也會(huì)存在影響。
三、 料
這里是指不局限于實(shí)驗(yàn)室的試劑和耗材，還包含檢測的樣本，檢測記錄和報(bào)告。
1、 樣本：要確保NGS檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，樣本的質(zhì)量起著關(guān)鍵性的決定作用，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定正確采集處理原始樣品、標(biāo)識(shí)及樣品質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)的文件化程序。
1.1 采集活動(dòng)前的指導(dǎo)：如采集的方法、影響采集方法的因素，樣本采集的類型和量、樣本存儲(chǔ)的容器和必需添加物。
1.2 采集活動(dòng)的指導(dǎo)：采集患者身份的確認(rèn)，采集樣本的原始標(biāo)識(shí)，采集時(shí)間等。
1.3 樣品的存儲(chǔ)和標(biāo)識(shí)：從樣品接收開始直到報(bào)告出具，樣品存儲(chǔ)溫度的要求、使用的保存液等，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)室流轉(zhuǎn)過程中都具有唯一性標(biāo)識(shí)，防止混淆。除了樣本本身的區(qū)別標(biāo)識(shí)，還應(yīng)該有樣品的狀態(tài)標(biāo)識(shí)，如待檢、檢測中、已檢三種狀態(tài)，分別存放在不同的區(qū)域中。
1.4 制定樣本的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)：如石蠟包埋(FFPE)的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織樣本，腫瘤細(xì)胞含量應(yīng)達(dá)20%以上，提取的DNA量應(yīng)大于50ng才能開始NGS的下一步檢測。如樣本質(zhì)檢不合格需要重新進(jìn)行采樣，如不進(jìn)行樣本的質(zhì)檢直接進(jìn)入下一道工序，到最后發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果不符合要求，耗時(shí)又耗錢，耽誤患者用藥時(shí)間。
2、 試劑
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定用于試劑的接收、驗(yàn)收、使用、存儲(chǔ)的文件，試劑到貨時(shí)進(jìn)行外觀及性能的進(jìn)貨驗(yàn)收，按照存儲(chǔ)溫度及批號(hào)規(guī)則進(jìn)行試劑的存放，按照批號(hào)、效期的原則錄入到系統(tǒng)并做好庫存卡，試劑領(lǐng)用做到先進(jìn)先出。商品化試劑在用于臨床樣本檢測應(yīng)進(jìn)行有效的性能驗(yàn)證（如準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性）。
NGS的商品試劑因都是低溫保存，一般都會(huì)有開瓶有限期和反復(fù)凍融次數(shù)要求，實(shí)驗(yàn)室在使用過程中需要及時(shí)記錄開瓶日期和凍融次數(shù)，使用時(shí)可根據(jù)需要進(jìn)行分裝，避免反復(fù)凍融。若分裝后的物料需要繼續(xù)保存，則應(yīng)注明物料名稱、原瓶開瓶日期、分裝日期等信息，確保試劑的可靠性。
3、 耗材
NGS實(shí)驗(yàn)室都會(huì)用到各種規(guī)格的移液器槍頭、PCR管、離心管等一次性耗材，市場上有眾多的廠家及規(guī)格型號(hào)，在NGS實(shí)驗(yàn)過程中請(qǐng)確保使用無菌、濾芯、低吸附的規(guī)格型號(hào)；同時(shí)確保無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。
4、 記錄和報(bào)告
記錄和報(bào)告也是一種特殊的物料，記錄設(shè)計(jì)要有檢測樣本、使用的設(shè)備編號(hào)、使用的試劑批號(hào)、檢測日期、檢測人、復(fù)核人、檢測結(jié)果的原始數(shù)據(jù)等信息，方便追溯。每個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)需要及時(shí)、準(zhǔn)確、真實(shí)填寫各種記錄，定期整理歸檔管理。檢測報(bào)告內(nèi)容應(yīng)包含但不局限于患者人員信息、病歷信息、樣本信息、所用試劑和分析軟件信息、檢測結(jié)果及解釋，報(bào)告人及有簽發(fā)報(bào)告資質(zhì)人員的簽名。報(bào)告應(yīng)簡潔扼要、通俗易懂。
四、 法
為了使NGS實(shí)驗(yàn)規(guī)范管理，操作標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要制定各種程序性文件、作業(yè)指導(dǎo)書、記錄表單，文件保持現(xiàn)行有效版本，方便員工隨時(shí)取閱，做到“有法可依、有法必依、執(zhí)法必嚴(yán)、違法必究”。
1、 程序性文件：可以參照CNAS-CL02:2012《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》的要素建立實(shí)驗(yàn)室管理的質(zhì)量手冊和程序性文件。
2、 操作性規(guī)程：可以采用圖文并茂的方式建立實(shí)驗(yàn)操作細(xì)節(jié)、設(shè)備操作規(guī)程、質(zhì)控方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等。
3、 記錄表單：可以根據(jù)NGS的工序如收樣、提取、建庫、純化、上機(jī)測序各工序形成全套的實(shí)驗(yàn)操作記錄；另外如設(shè)備使用、維護(hù)、保養(yǎng)記錄、溫濕度監(jiān)控記錄、試劑的配置記錄等配套的各類表單，均由質(zhì)量部受控發(fā)放使用。
五、 測
為了提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性所采取的有關(guān)措施和活動(dòng)。
1、 實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)評(píng)（EQA）：也叫室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，是國家衛(wèi)健委利用各實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)來確定實(shí)驗(yàn)室能力的活動(dòng)，實(shí)際上它是指為確保實(shí)驗(yàn)室維持較高的檢測水平而對(duì)其能力進(jìn)行考核、監(jiān)督和確認(rèn)的一種驗(yàn)證活動(dòng)。這是NGS實(shí)驗(yàn)室證明自己能力的一種很好的方式，也是自己實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力在行業(yè)中展示的一個(gè)窗口，應(yīng)該積極報(bào)名參加。
2、 實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)：實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)是按照預(yù)先規(guī)定的條件，由兩個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)相同或類似的測試樣品進(jìn)行檢測的組織、實(shí)施和評(píng)價(jià)，從而確定實(shí)驗(yàn)室能力、識(shí)別實(shí)驗(yàn)室存在的問題與實(shí)驗(yàn)室間的差異，是判斷和監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室能力的有效手段之一。
3、 人員比對(duì)：為了提高自己實(shí)驗(yàn)室人員的技能，建議定期開展人員比對(duì)活動(dòng)，這是維持和提高檢驗(yàn)人員能力水平的一種很好的手段。倡導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室形成你追我趕的氛圍，不斷提升實(shí)驗(yàn)人員的技能。
4、 盲樣測試：能直接反映實(shí)驗(yàn)室的儀器設(shè)備和技術(shù)水平，可以作為實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員轉(zhuǎn)正考核的一種手段。
5、 陽性對(duì)照和陰性對(duì)照：每次檢測都必須放置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，作為最終判斷結(jié)果的參考依據(jù)。陰性質(zhì)控品(NC)的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性，若其中有突變檢出，說明環(huán)境中可能存在DNA污染源。陽性質(zhì)控品(PC)的檢測結(jié)果應(yīng)為某個(gè)基因突變對(duì)應(yīng)陽性，如果突變未檢出，說明試劑盒性能不理想或操作過程有誤，此次檢測結(jié)果無效。
六、 環(huán)
這里是指檢測過程中的實(shí)驗(yàn)室硬件環(huán)境。
1、 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)布局：NGS實(shí)驗(yàn)室設(shè)置應(yīng)該嚴(yán)格按照國家衛(wèi)健委高通量測序?qū)嶒?yàn)室的要求進(jìn)行，申請(qǐng)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收，標(biāo)準(zhǔn)化分區(qū)及空氣流向，確保工作有序，互不干擾，防止污染。
一般腫瘤領(lǐng)域二代測序分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本與文庫制備區(qū)、DNA打斷區(qū)、雜交捕獲區(qū)（擴(kuò)增一區(qū)）、文庫擴(kuò)增區(qū)（擴(kuò)增二區(qū)）、文庫檢測區(qū)、測序區(qū)、電泳區(qū)共八個(gè)區(qū)，每個(gè)房間壓差依次梯度≥5Pa，設(shè)置PCR專用走廊和緩沖間，在緩沖間內(nèi)，可設(shè)置正壓，使室內(nèi)空氣不流向室外，室外空氣不流向室內(nèi)。嚴(yán)格人流物流分開，嚴(yán)格遵守從一區(qū)到八區(qū)的單一方向制度，不得反向進(jìn)入前一個(gè)區(qū)，盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)，以減少交叉污染。
2、 區(qū)域管理：在各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服和物品（如不同顏色），每個(gè)工作區(qū)域均有專用的儀器設(shè)備，各區(qū)域儀器設(shè)備須有明確的標(biāo)記，避免設(shè)備物品如加樣器等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出。當(dāng)工作人員離開時(shí)，不得將本區(qū)的工作服、手套、口罩和物品帶到其他區(qū)域，從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆污染。
3、 環(huán)境衛(wèi)生：每個(gè)區(qū)域都應(yīng)該有獨(dú)立的清潔工具，每個(gè)區(qū)域的清潔工具不得混用，清潔時(shí)按照從一區(qū)到八區(qū)的單一方向制度。工作結(jié)束后用75%的乙醇擦拭工作臺(tái)面，用紫外線燈（建議安裝無臭紫外燈）進(jìn)行照射，同時(shí)注意實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)換氣。
國家原衛(wèi)計(jì)委李大川處長在近期會(huì)議上肯定了近年來分子檢測在臨床中的突出貢獻(xiàn)，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，分子檢測不僅有助于疾病的診斷分類，而且加深了人們對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)，指導(dǎo)疾病的靶向治療。但是NGS檢測的質(zhì)量控制仍然存在問題：實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)室人員水平、質(zhì)量保證手段等。我們只有有效運(yùn)用“5M1E”分析法，規(guī)范NGS實(shí)驗(yàn)室管理，保證質(zhì)量，向臨床提供真實(shí)、客觀、準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，才能更好地為大眾健康服務(wù)。
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