原位雜交的原理是含有互補(bǔ)序列（探針）的被標(biāo)記的單鏈DNA或RNA片段在適當(dāng) 的條件下與細(xì)胞的DNA或RNA雜交形成穩(wěn)定的雜交體。無論是DNA(dsDNA、寡核苷酸和ssDNA)或是RNA(SSC RNA)探針均能用于定位DNA和mRNA，并且均能用于兩個(gè)主要類型的標(biāo)記策略：直接標(biāo)記，即用報(bào)道分子（如同位素）附著于DNA或RNA；間接標(biāo)記，在該法中將半抗原（如生物素或地高辛）附著于探針上，然后用標(biāo)記的結(jié)合蛋白(如親合素）檢測(cè)或者用特異性的抗體檢測(cè)靶探針雜交體
1. 組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12 h。
2. 脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。
3. 切片：石蠟經(jīng)切片機(jī)切片，攤片機(jī)撈片，62℃烤箱烤片2 h。
4. 石蠟切片脫蠟至水
5. 消化：根據(jù)組織固定時(shí)間長(zhǎng)短，切片于修復(fù)液中煮沸10-15min，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37℃消化
6. 預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液，37°C孵育1 h。
7. 雜交：傾去預(yù)雜交液，滴加含探針雜交液, 恒溫箱37°C雜交過夜。
8. 雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C洗10 min，1×SSC，37°C洗10 min，0.5×SSC室溫洗10 min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。
9. DAPI復(fù)染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8 min，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。
10. 鏡檢拍照：切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)420 nm,發(fā)藍(lán)光；FAM(488)綠光激發(fā)波長(zhǎng)465-495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515-555 nm，發(fā)綠光；CY3紅光激發(fā)波長(zhǎng)510-560 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm，發(fā)紅光)DAPI染核，為藍(lán)光。
1. 冰切。標(biāo)本放原位雜交固定液中，常溫運(yùn)輸；冰凍切片-20°運(yùn)輸。
2. 石蠟。標(biāo)本放原位雜交固定液中，常溫運(yùn)輸；石蠟切片常溫運(yùn)輸。
3. 細(xì)胞爬片。細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15 min后，密封，4°C運(yùn)輸。共聚焦皿
4. 新鮮組織：組織取出后可以立即冷凍處理，后干冰運(yùn)輸?shù)轿錆h進(jìn)行后續(xù)冰凍切片處理。新鮮組織-80°C保存。
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