敲除細(xì)胞株構(gòu)建技術(shù)原理：Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期進(jìn)化而形成的一種適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以用于各種基因組的編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)會通過小導(dǎo)向RNA(sgRNA)對切割區(qū)域進(jìn)行識別，并利用Cas9內(nèi)切酶實(shí)現(xiàn)在識別位點(diǎn)中間預(yù)測的位置切割，造成DNA雙鏈斷裂，在細(xì)胞進(jìn)行易錯修復(fù)后造成隨機(jī)的突變。CRISPR/Cas9系統(tǒng)其突變效率高、靈活簡單，周期短，成本低，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于基因編輯的研究。CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用最多的領(lǐng)域是基因敲除株系構(gòu)建和基因敲除動物的研究。
CRISPR/Cas基因組編輯原理可提供項目服務(wù)包括：CRISPR/Cas9實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計、CRISPR/Cas9基因敲除載體構(gòu)建、CRISPR/Cas9基因敲除載體病毒包裝、CRISPR/Cas9基因敲除細(xì)胞株構(gòu)建。
服務(wù)特點(diǎn)：1.定制特定基因敲除細(xì)胞系只需提供基因名稱；2.快速獲得有效sgRNA，基因編輯效率高；3.實(shí)驗(yàn)周期短；4.可根據(jù)需要提供CRISPR/Cas9慢病毒包裝服務(wù)。
操作流程：1.靶向目的序列sgRNA的設(shè)計、載體構(gòu)建及活性驗(yàn)證；2.目的細(xì)胞系共轉(zhuǎn)染，初步篩選混合克?。?.鋪單克隆，單克隆篩選及鑒定細(xì)胞基因型；4.陽性細(xì)胞株的擴(kuò)增。
雙螢光素酶檢測
螢光素酶是理想的報告基因，因?yàn)椴溉閯游锛?xì)胞中不含內(nèi)源性螢光素酶，一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶。單報告基因?qū)嶒?yàn)往往會受到各種實(shí)驗(yàn)條件的影響，而雙報告基因則通過共轉(zhuǎn)染的“對照”作為內(nèi)參為試驗(yàn)提供一基準(zhǔn)線，從而可以在最大程度上減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對實(shí)驗(yàn)的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。Dual-Luciferase?雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在細(xì)胞中同時表達(dá)螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶，兩者沒有種源同源性并對應(yīng)不同的反應(yīng)底物，故而沒有交叉干擾。得益于超強(qiáng)的光信號和超高的信噪比。
miRNA靶基因驗(yàn)證
miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻譯），將目的基因3’UTR（野生型和結(jié)合位點(diǎn)突變型）序列構(gòu)建至載體中報告基因F-Luc的3’端，通過比較過表達(dá)miRNA后，報告基因表達(dá)的改變（螢光素酶的活性下降還是不變），來確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。
目的：驗(yàn)證 miRNA與靶基因3’UTR 是否發(fā)生調(diào)控作用。
材料：質(zhì)粒pMIR-REPORT Luciferase基因3'UTR（Wt）；pMIR-REPORT Luciferase-基因3'UTR（Mut）；pRL-CMV（H321，Promega）；293T細(xì)胞株
步驟：靶點(diǎn)預(yù)測——構(gòu)建質(zhì)粒——轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測——報告基因檢測（Luciferase活性檢測）——統(tǒng)計分析
結(jié)果：
啟動子活性研究轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式因子，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式因子實(shí)現(xiàn)共價結(jié)合，從而對基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。
轉(zhuǎn)錄因子主要通過作用于靶基因的啟動子起作用，將目的基因啟動子區(qū)序列替換報告基因F-Luc的啟動子，通過共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子后，報告基因表達(dá)的改變，來確定轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子結(jié)合位點(diǎn)及對靶基因的作用。
目的：檢測轉(zhuǎn)錄因子對目的基因啟動子活性的影響
材料：實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒（pGL4.10-基因promotor）；對照質(zhì)粒； pRL-CMV（E2261，Promega）；轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒；293T細(xì)胞株
步驟：靶點(diǎn)預(yù)測——構(gòu)建質(zhì)?！D(zhuǎn)染細(xì)胞檢測——報告基因檢測（Luciferase活性檢測）——統(tǒng)計分析
結(jié)果：
客戶需提供信息：1.靶基因名稱2.靶基因種屬3.調(diào)控因子（miRNA或者轉(zhuǎn)錄因子）名稱提供給客戶：1.結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果2.質(zhì)粒及其構(gòu)建報告3.雙熒光素酶檢測報告
外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)可分為兩大類，一類是瞬時表達(dá)，外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，雖然可以達(dá)到高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天；一類是穩(wěn)定表達(dá)（構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株），外源DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上，使宿主細(xì)胞可長期表達(dá)目的基因。
建立穩(wěn)定細(xì)胞株，基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標(biāo)志進(jìn)行篩選。最常用的真核表達(dá)載體的抗性篩選標(biāo)志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，篩選得到可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白、或穩(wěn)定沉默特定基因的細(xì)胞株。
篩選方法：
慢病毒感染篩選穩(wěn)定細(xì)胞株
利用慢病毒整合表達(dá)特性來篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，該方法克服了傳統(tǒng)質(zhì)粒挑單克隆方法周期久的弊端，可以在短時間內(nèi)高效獲取穩(wěn)定細(xì)胞株。
利用慢病毒制備穩(wěn)定株優(yōu)勢：
（1）細(xì)胞適用種類廣泛，可用于各種哺乳動物細(xì)胞；
（2）構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株時間短，表達(dá)持續(xù)時間長；
（3）多種熒光標(biāo)記和抗性基因可選，滿足觀測實(shí)驗(yàn)要求。
穩(wěn)定細(xì)胞株分類：
混合克隆穩(wěn)定細(xì)胞株
混合克隆細(xì)胞系是基因轉(zhuǎn)染后直接用抗藥篩選得到的，篩選出的細(xì)胞都表達(dá)抗性基因和目的基因，但包含了各種不同的細(xì)胞克隆。不同克隆的目的基因整合位置和表達(dá)量均有所不同。
混合克隆細(xì)胞株篩選比較快速，費(fèi)用較低。在需要構(gòu)建的細(xì)胞株轉(zhuǎn)染效率高，目的基因表達(dá)效率高的情況下，單克隆細(xì)胞株最后得到的表達(dá)效果和混合克隆細(xì)胞株并沒有顯著差異，這時多克隆細(xì)胞篩選是理想的選擇。
單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株
單克隆細(xì)胞系是由含有穩(wěn)定整合外源片段的單個細(xì)胞的擴(kuò)增得到的細(xì)胞株，每個細(xì)胞的目的基因整合位置的表達(dá)量均高度一致，但可能丟失一些表型。單克隆細(xì)胞株篩選周期長，費(fèi)用高。需要進(jìn)行細(xì)胞亞定位實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系，難感染的和表達(dá)率低的通常建議進(jìn)行單克隆細(xì)胞篩選。
服務(wù)流程
已構(gòu)建的穩(wěn)定株列表（部分）：
1.細(xì)胞增殖
細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等是腫瘤研究的重要表型，是分子生物學(xué)和藥理學(xué)研究解決的問題之一。通過在細(xì)胞中過表達(dá)或干擾某個基因研究基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響，進(jìn)一步研究基因的功能，或?qū)?xì)胞進(jìn)行藥物處理，研究藥物對增殖的影響。
實(shí)驗(yàn)原理(CCK-8) 細(xì)胞增殖是生物體的重要生命特征，細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖，是生物體生長、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)。細(xì)胞增殖的研究方法有很多，主要包括：CCK8/ CellTiter-Glo?等方法。
Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。
CCK-8方法優(yōu)勢：（1）操作簡單，避免細(xì)胞計數(shù)過程中人為因素的影響；（2）細(xì)胞用量少，檢測靈敏度高，穩(wěn)定；（3）可反復(fù)用酶標(biāo)儀讀板，檢測時間靈活，不影響細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；（4）CCK-8產(chǎn)生的Formazan是水溶性的，無需換液，尤其適用于懸浮細(xì)胞,與MTT法相比更方便，更安全。
目的：考察目的基因?qū)?xì)胞的增殖能力產(chǎn)生的影響或藥物對細(xì)胞增殖能力的影響
材料：目的細(xì)胞、穩(wěn)轉(zhuǎn)株（空載、目的基因）步驟：細(xì)胞收集——細(xì)胞鋪板——（藥物處理）——細(xì)胞培養(yǎng)0、6、24、48、72小時后加入CCK-8處理，酶標(biāo)儀檢測
結(jié)果：
實(shí)驗(yàn)原理(CellTiter-Glo?)
ATP腺嘌呤核苷三磷酸(簡稱三磷酸腺苷)參與生物體內(nèi)多種酶促反應(yīng)，是活細(xì)胞新陳代謝的一個指標(biāo)，其含量直接反應(yīng)了細(xì)胞的數(shù)量及細(xì)胞狀態(tài)：實(shí)驗(yàn)過程中向細(xì)胞培養(yǎng)基加入等體積CellTiter-Glo?試劑，測量發(fā)光值，在光信號和體系中，發(fā)光值與ATP量成正比，而ATP又和活細(xì)胞數(shù)正相關(guān)，因此可通過檢測ATP含量得細(xì)胞活力。
CTG方法優(yōu)勢：（1）同普通的MTT、CCK8法相比，CellTiter-Glo?發(fā)光活細(xì)胞檢測系統(tǒng)的檢測試劑具有最高靈敏度和較長的信號持續(xù)時間，此系統(tǒng)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中，如一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等;（2）CellTiter-Glo?試劑和細(xì)胞培養(yǎng)中的常用培養(yǎng)基兼容，如RPMI1640、MEM、DMEM和 Ham's F12，也不受酚紅和有機(jī)溶劑的影響，誤差小，準(zhǔn)確率高。
目的：考察目的基因?qū)?xì)胞的增殖能力產(chǎn)生的影響或藥物對細(xì)胞增殖能力的影響
材料：目的細(xì)胞步驟：細(xì)胞收集——細(xì)胞鋪板——（藥物處理）——細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48、72、96小時后加入CellTiter-Glo?溶液用微孔板震蕩器5分鐘，于室溫放置10分鐘-酶標(biāo)儀檢測熒光值
結(jié)果：
MTT CCK8 CTG 檢測方法對比
2 細(xì)胞凋亡
細(xì)胞凋亡是腫瘤和發(fā)育研究的重點(diǎn)，同時也是藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自主結(jié)束其生命的過程。它是一個主動的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。細(xì)胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段：接受凋亡信號→凋亡調(diào)控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過程。
基本原理
細(xì)胞凋亡檢測采用Annexin V/PI雙染法檢測，Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）高親和力特異性結(jié)合。在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。將Annexin V 進(jìn)行熒光素（FITC或PE）或Biotin 標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V 作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
7-AAD類似于碘化丙啶（propidine iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，7-AAD能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin V 與7-AAD 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。
目的： 通過慢病毒感染獲得過表達(dá)某基因的細(xì)胞株，利用Annexin-PE和7-AAD雙染法對正常細(xì)胞、對照組細(xì)胞、基因過表達(dá)組細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測，研究基因?qū)?xì)胞凋亡的影響。
材料：質(zhì)粒與細(xì)胞株
步驟：細(xì)胞準(zhǔn)備——收集細(xì)胞——Annexin-PE和 7-AAD進(jìn)行雙染色——流式上機(jī)檢測結(jié)果：
3 細(xì)胞侵襲和遷移
在腫瘤發(fā)展過程中，細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的能力是重要的研究對象。相關(guān)的信號通路主要可以分為控制細(xì)胞黏附和控制細(xì)胞骨架。細(xì)胞的遷移與侵襲主要與細(xì)胞骨架和黏附相關(guān)。腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的改變通常采用Transwell進(jìn)行檢測。細(xì)胞劃痕也是測定腫瘤細(xì)胞運(yùn)動特性的方法，由于無法區(qū)別正常增殖和遷移細(xì)胞，應(yīng)用有局限性。
Transwell實(shí)驗(yàn)
Transwell小室底層的一張有通透性的膜（一般為聚碳酸酯膜），將其放置于孔板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞。應(yīng)用Transwell可研究下層培養(yǎng)液中的成分對細(xì)胞生長、運(yùn)動等的影響。
腫瘤遷移實(shí)驗(yàn)：研究腫瘤細(xì)胞的遷移能力或特定情況下腫瘤細(xì)胞的遷移能力。常用8.0、12.0μm膜，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，計數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。
腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)：研究腫瘤細(xì)胞的侵襲能力或特定情況下腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。在聚碳酸酯膜上涂上一層基質(zhì)膠，模仿細(xì)胞外基質(zhì)，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，細(xì)胞要把基質(zhì)消化后才可以從上室遷移到下室，計數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量測定細(xì)胞的侵襲能力。
目的： 研究目的基因過表達(dá)/干擾對細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響
材料：正常細(xì)胞、對照慢病毒、過表達(dá)基因慢病毒
步驟：細(xì)胞復(fù)蘇——Transwell鋪板——細(xì)胞培養(yǎng)及染色——拍照
結(jié)果：
劃痕實(shí)驗(yàn)原理
腫瘤細(xì)胞在體外仍具有遷移的能力。細(xì)胞劃痕法是測定了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動特性的方法之一。其借鑒體外細(xì)胞致傷愈合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停隗w外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上，劃痕致傷，然后比較不同實(shí)驗(yàn)組中腫瘤細(xì)胞遷移的能力。
目的： 使用篩選的穩(wěn)定株（轉(zhuǎn)對照病毒、過表達(dá)基因病毒），通過對空細(xì)胞、對照穩(wěn)轉(zhuǎn)、目的基因穩(wěn)轉(zhuǎn)三組細(xì)胞進(jìn)行劃痕寬度進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，研究基因?qū)?xì)胞遷移能力的影響。
材料：病毒和細(xì)胞株，目的細(xì)胞來源于客戶，穩(wěn)定株和元構(gòu)建
步驟：細(xì)胞鋪板——劃線——細(xì)胞培養(yǎng)及拍照——統(tǒng)計分析
結(jié)果：
4 細(xì)胞周期檢測
細(xì)胞周期（cell cycle）是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度，單個細(xì)胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。
基本原理：
細(xì)胞周期各時相的DNA含量不同，通常正常細(xì)胞的 G0/G1期具有二倍體細(xì)胞的DNA 含量(2N)，而G2/M期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。PI 即碘化丙錠，可以與細(xì)胞內(nèi)DNA 和RNA 結(jié)合，采用RNA酶將RNA消化后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到的與DNA 結(jié)合的PI 的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。
因此，通過流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測時，可以將細(xì)胞周期各時相區(qū)分為 G0/G1期，S 期和G2/M期，并可通過特殊軟件計算各時相的百分率。
目的： 通過慢病毒感染獲得基因過表達(dá)的細(xì)胞株，利用PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期的變化。從而研究目的基因?qū)?xì)胞周期的影響。
材料：目的細(xì)胞、病毒
步驟：細(xì)胞準(zhǔn)備——樣品收集——上機(jī)檢測——數(shù)據(jù)分析
結(jié)果：
5.克隆形成實(shí)驗(yàn)
基本原理：
單個細(xì)胞在體外增殖6代以上（時間約1周以上），其后代所形成的細(xì)胞群體，稱為集落或克隆。每個克隆含有50個以上的細(xì)胞，大小在0.3 - 1.0mm之間。細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)， 但貼壁后的細(xì)胞不一定每個都能增殖并形成克隆。只有同時具有貼壁和增殖活力的細(xì)胞才會形成克隆?？寺⌒纬陕史从臣?xì)胞的獨(dú)立生存能力的強(qiáng)弱，用于評價細(xì)胞群體依賴性和增殖能力。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng)； 二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。
克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成率測定時，接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液，直接接種在培養(yǎng)皿中，持續(xù)一周以上，隨時檢查，到細(xì)胞形成克隆時終止培養(yǎng)。
目的：通過目的基因過表達(dá)/干擾細(xì)胞組、空細(xì)胞組與陰性對照組(空病毒)克隆形成數(shù)量的統(tǒng)計學(xué)分析，研究基因?qū)?xì)胞群體依賴性和增殖能力的影響。
材料：病毒和細(xì)胞株
步驟：鋪板——細(xì)胞培養(yǎng)——觀察克隆，染色，計算克隆形成率
結(jié)果：
