背景簡(jiǎn)介
iTRAQ ( Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation) 技術(shù)是ABI公司推出的一項(xiàng)新的體外同位素標(biāo)記技術(shù)。使用該技術(shù)可以對(duì)一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜的混合體系中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量和鑒定。尋找差異表達(dá)蛋白，并揭示其細(xì)胞生理病理功能。聯(lián)川生物依托先進(jìn)的蛋白質(zhì)譜分析平臺(tái)、強(qiáng)大的信息分析和數(shù)據(jù)處理能力，為用戶(hù)提供高效的蛋白質(zhì)組鑒定與定量分析服務(wù)。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
通量高：一次實(shí)驗(yàn)即可對(duì)數(shù)千種蛋白進(jìn)行定量分析，且最多可同時(shí)對(duì)8份樣本進(jìn)行定量分析
結(jié)果可靠：蛋白分析的靈敏度、特異性及重復(fù)性遠(yuǎn)高于雙向電泳，并且定性與定量分析同步完成
覆蓋廣泛：鑒定與定量分析樣本中表達(dá)的所有已知蛋白，包括高分子量蛋白、酸堿性蛋白、膜蛋白和不溶性蛋白等
支持關(guān)聯(lián)分析：綜合上游轉(zhuǎn)錄組等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，提供多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析
技術(shù)路線(xiàn)
分析內(nèi)容
樣本類(lèi)型
細(xì)胞，組織，尿液，全血，血清，血漿，總蛋白等
建議總蛋白起始量（單次）：≥ 500 μg，濃度≥1μg/μL
用戶(hù)文章：
1.Wang L，et al. Proteome profiling reveals immune responses in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) infected with Edwardsiella tarda by iTRAQ analysis. Fish Shellfish Immunol. 2017 Jul;66:325-333. doi: 10.1016/j.fsi.2017.05.022
2.Zhang G, Zhang J, Wen X, et al. Comparative iTRAQ-based quantitative proteomic analysis of Pelteobagrus vachelli liver against acute hypoxia: Implications in metabolic responses.[J]. Proteomics, 2017.
3.Li R, Yu H, Yue Y, et al. Combined proteomics and transcriptomics identifies sting-related toxins of jellyfish Cyanea nozakii.[J]. Journal of Proteomics, 2016, 148:57.
4.Lv LX, et al.(2016) Integrated transcriptomic and proteomic analysis of the bile stress response in probiotic Lactobacillus salivarius LI01. Journal of Proteomics. doi.org/10.1016/j.jprot.2016.08.021
5.Lv LX, et al.(2016) Integrated transcriptomic and proteomic analysis of the bile stress response in probiotic Lactobacillus salivarius LI01. Journal of Proteomics. doi.org/10.1016/j.jprot.2016.08.021
6.Wang C, Liu C, Wei L, Shi L, Pan Z, Mao L, Wan X, Ping Z, Jiang T, Chen Z. (2016) A Group of Novel Serum Diagnostic Biomarkers for Multidrug-Resistant Tuberculosis by iTRAQ-2D LC-MS/MS and Solexa Sequencing. International Journal of Biological Sciences 12(2), 246-256.
7.Cui Y, et al. (2016) Transcriptomic/proteomic identification of allergens in the mite Tyrophagus putrescentiae. Allergy.DOI:10.1111/all.12999
8.Cao JY, et al. (2016) TMT-based quantitative proteomics analyses reveal novel defense mechanisms of B
Q1：iTRAQ能否鑒定新蛋白？
A：iTRAQ不能鑒定新蛋白，只能做定量。定量的基本原理是根據(jù)肽段上報(bào)告基團(tuán)信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)計(jì)算，不涉及內(nèi)參蛋白。同時(shí)，不能做未知蛋白鑒定。iTRAQ產(chǎn)品的分析都是基于對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的篩查，所以必須是序列已知的蛋白才可以檢測(cè)到。
Q2：iTRAQ蛋白定量能鑒定多少個(gè)蛋白，為什么有些物種鑒定到蛋白那么少？
A：對(duì)于可鑒定蛋白的數(shù)量確實(shí)因物種有差異，原因是鑒定蛋白是通過(guò)篩查蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)進(jìn)行的，如果某個(gè)物種沒(méi)有很好的基因組注釋信息或轉(zhuǎn)錄組注釋信息，篩查得到的信息也會(huì)很少。尤其是植物類(lèi)、昆蟲(chóng)類(lèi)、水產(chǎn)品類(lèi)非模式物種，往往只能鑒定不到1k個(gè)蛋白。
Q3：蛋白鑒定是不是一定要依賴(lài)于數(shù)據(jù)庫(kù)？
A：是的，所有蛋白產(chǎn)品里的蛋白鑒定，都是需要依賴(lài)數(shù)據(jù)庫(kù)的。數(shù)據(jù)庫(kù)信息的完整性，將對(duì)蛋白鑒定的結(jié)果產(chǎn)生一定影響。
Q4：iTRAQ結(jié)果的后期驗(yàn)證？
A：一般選擇注釋結(jié)果與所關(guān)注的生物過(guò)程緊密相關(guān)的蛋白或者差異顯著的蛋白來(lái)做后期驗(yàn)證。iTRAQ的后期驗(yàn)證，通常采用western blot。而植物中，可用抗體較少，通常的處理方式是不驗(yàn)證或是自行制備多抗進(jìn)行驗(yàn)證；亦可進(jìn)行mRNA的定量qPCR驗(yàn)證，找mRNA和蛋白的關(guān)聯(lián)。兩種方式都已有文章發(fā)表。
轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析益生菌唾液乳桿菌LI01的膽汁應(yīng)激反應(yīng)
研究背景
最近發(fā)現(xiàn)幾種唾液乳桿菌菌株，表現(xiàn)出良好的益生菌性質(zhì)，如抗菌活性，炎癥調(diào)節(jié)，甚至是腫瘤性病變減少等。從健康人體內(nèi)分離的唾液乳桿菌LI01已經(jīng)在預(yù)防和治療肝衰竭中表現(xiàn)出了益生菌性質(zhì)。對(duì)膽汁的耐受對(duì)于乳桿菌在胃腸道中的存活和發(fā)揮其益處至關(guān)重要。
研究結(jié)果
通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和iTRAQ蛋白質(zhì)組定量分析后發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照相比，添加ox膽汁溶液培養(yǎng)的LI01菌株中檢測(cè)到591個(gè)差異表達(dá)的基因和347個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。利用GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因主要參與脅迫應(yīng)答，糖酵解和轉(zhuǎn)運(yùn)以及諸如碳水化合物代謝和氨基酸生物合成等途徑；差異表達(dá)的蛋白質(zhì)主要參與DNA修飾、基因表達(dá)和細(xì)胞組分降解和代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)。
圖 差異表達(dá)基因及差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG富集分析
研究還發(fā)現(xiàn)，LI01的膽汁耐受能力是基于高度重塑的細(xì)胞包膜以及增強(qiáng)的膽汁外排系統(tǒng)，而不是基于膽鹽水解酶的活性。一些差異表達(dá)的基因是與調(diào)節(jié)系統(tǒng)即應(yīng)激反應(yīng)和中樞代謝過(guò)程相關(guān)的基因，也在膽汁誘導(dǎo)的損傷預(yù)防和能量效率中起作用。此外，膽汁鹽似乎增強(qiáng)了LI01的蛋白水解和氨基酸攝取（特別是芳香族氨基酸）能力，這個(gè)結(jié)果表明該菌株具有肝保護(hù)的性質(zhì)。
總而言之，本研究的開(kāi)展建立了唾液乳桿菌LI01中膽汁應(yīng)激的全局反應(yīng)機(jī)制的模型。
參考文獻(xiàn)
Lv LX, et al.(2016) Integrated transcriptomic and proteomic analysis of the bile stress response in probiotic Lactobacillus salivarius LI01.Journal of Proteomics. doi.org/10.1016/j.jprot.2016.08.021
KEGG注釋根據(jù)KEGG注釋總表，可以對(duì)注釋到KEGG的差異蛋白總體情況進(jìn)行Unigene數(shù)目的統(tǒng)計(jì)。
KOG/COG注釋COG（Clusters of Orthologous Groups of proteins），即同源蛋白簇。一般原核 生物用COG，真核生物用KOG。COG注釋作用：1. 通過(guò)已知蛋白對(duì)未知序列進(jìn)行功能注釋?zhuān)?. 通過(guò)查看指定的COG編號(hào)對(duì)應(yīng)的protein數(shù)目，存在及缺失，從而能推導(dǎo)特定的代謝途徑是否存在； 3. 每個(gè)COG編號(hào)是一類(lèi)蛋白，將query序列和比對(duì)上的COG編號(hào)的proteins 進(jìn)行多序列比對(duì)，能確定保守位點(diǎn)，分析其進(jìn)化關(guān)系。
GO富集分析GO分為三個(gè)功能：生物進(jìn)程（biological process） 細(xì)胞組成（cellular component）分子功能（molecular function）。一般進(jìn)行分析時(shí)，會(huì) 取前50個(gè)差異較為明顯的蛋白繪制GO注釋圖。分別對(duì)應(yīng)這三個(gè)功能的差 異蛋白數(shù)量為25個(gè)，15個(gè)以及10個(gè)。
蛋白質(zhì)network網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建蛋白與蛋白的互作關(guān)系一般用String軟件繪制，String可以用來(lái)查找蛋白間的作用關(guān)系及作用強(qiáng)度，同時(shí)也可以查看單個(gè)蛋白與其他相關(guān)聯(lián)的上下游關(guān)系，可以為老師研究蛋白互作關(guān)系提供思路 。
二維碼.jpg)
掃一掃，反饋當(dāng)前頁(yè)面
7*12 專(zhuān)業(yè)客服，服務(wù)咨詢(xún)
微信公眾號(hào)