常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測序由于文庫PCR擴增偏好性，所有序列并不會被同比例放大，因而造成測序定量結(jié)果與樣本中轉(zhuǎn)錄本的原始豐度不一致，導致差異基因篩選不準確（圖1）。這也是造成qPCR驗證測序結(jié)果不一致的主要原因。聯(lián)川生物推出的絕對定量轉(zhuǎn)錄組測序，采用主流UMI標記技術[1,2,3]，通過UMI標記每一條序列，可以消除PCR擴增偏好對定量的干擾，真實反映樣本中轉(zhuǎn)錄本的表達豐度（圖2）。在文庫PCR擴增和測序過程中難免會引入錯誤的堿基，具有相同UMI標記的序列可以基于多序列比對來糾正PCR擴增和測序過程中引入的錯誤，確保獲得轉(zhuǎn)錄本的真實序列（見圖3）。
圖1 PCR擴增產(chǎn)生的duplication顯著干擾準確定量
圖2 UMI標記技術消除duplication干擾
圖3 UMI標記技術糾正序列錯誤
真實定量：采用UMI標記技術，每一條序列都被唯一標識，保留序列真重復，去除PCR擴增假重復，真實反映樣本中轉(zhuǎn)錄本的表達豐度。真實序列：具有相同UMI標記的序列可以基于多序列比對來糾正PCR擴增和測序過程中引入的錯誤, 確保獲得轉(zhuǎn)錄本的真實序列。
細胞，組織，全血，血清，血漿，總RNA等
建議總RNA起始量：2 μg，最低1 μg，濃度≥50 ng/μL
參考文獻
1.Shiroguchi K, et al. Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jan 24;109(4):1347-52.2.Kivioja T, et al. Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers. Nat Methods. 2011, 9(1):72-43.Saiful Islam, et al. Quantitative single-cell RNA-seq with unique molecular identifiers. Nature Methods 2014, 11:163-166.
A1：主要有這6個原因：1）文庫PCR擴增偏好，2）你驗證的分子不對，3）用不同批次的樣品做驗證，4）用不同的樣本類型做驗證，5）拿低表達或差異不顯著的基因做驗證，6）樣本比對關系搞反。查看詳情
A2：使用絕對定量轉(zhuǎn)錄組測序，助您篩選出真實的差異表達基因，讓你的時間不再花在假陽性結(jié)果的驗證上，更快地開展下游功能驗證實驗，快人一步地發(fā)表研究成果。
這項工作討論了如何最小化PCR擴增偏好性（就是Duplication）對測序數(shù)據(jù)，特別是低拷貝序列，定量分析的干擾。研究團隊開發(fā)出了一種稱為Digital RNA sequencing的方法：序列在反轉(zhuǎn)錄后，加入大量的標簽（barcode），幾乎每個cDNA都被唯一的barcode標記，然后進行PCR擴增獲得轉(zhuǎn)錄組測序文庫（見下圖）。由于序列是被barcode唯一標記的，計算序列拷貝數(shù)時，不再直接統(tǒng)計同一種reads的數(shù)量，而是統(tǒng)計每種reads有多少個unique的barcode。而具有相同barcode的同一種reads，無論有多少拷貝數(shù)，都只計作一個拷貝，即來自PCR擴增的假重復（Duplication）被有效去除。
可以簡單地認為，在樣本中cDNA1有3個拷貝，cDNA2有2個拷貝，比例為3:2，然后用大量不同的barcode標記這5條序列，每條序列都被unique的barcode標記，最后進行PCR擴增完成文庫制備。由于Duplication的存在，在沒有barcode標記的情況下，cDNA1經(jīng)擴增變成了9個拷貝，cDNA2變成了12個拷貝，比例變成了3:4，而兩者原始的比例是3:2；而標記了barcode的cDNA1和cDNA2，合并具有相同barcode的同種序列后，cDNA1和cDNA2仍保持原始的拷貝數(shù)和比例，此種方案下測序定量結(jié)果準確反映了樣本中序列的真實豐度和比例。
圖 標簽標記序列法去除Duplication的原理
Shiroguchi K, et al. Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jan 24;109(4):1347-52.
差異基因聚類分析熱圖
用于判斷基因在不同實驗條件下調(diào)控模式的聚類模式根據(jù)樣品基因表達譜的相近程度，將基因進行聚類分析，直觀地展示基因在不同樣品（或是不同處理）中的表達情況，由此獲取生物學相關信息。
差異顯著差異表達基因上下調(diào)頻數(shù)統(tǒng)計柱狀圖用于統(tǒng)計差異基因數(shù)目
差異表達基因分析火山圖
用于了解差異表達基因的整體分布情況。以log2(foldchange)為橫坐標，-log10(pvalue)為縱坐標，對差異表達分析中所有的基因繪制火山圖。其中橫坐標代表基因在不同樣本中差異表達倍數(shù)變化；縱坐標代表基因表達量變化差異的統(tǒng)計學顯著性。
差異基因GO富集柱狀圖
用于反映在生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)富集的GO term上差異基因的個數(shù)分布情況。
GO功能富集散點圖
用于展示GO term的富集情況。Rich factor表示位于該GO的差異基因個數(shù)/位于該GO的總基因數(shù)，Rich factor越大，GO富集程度越高。
皮爾森相關系數(shù)圖
用于反映生物學重復、樣本相關性，確保后續(xù)的差異基因分析得到更可靠的結(jié)果。
可變剪切統(tǒng)計圖
對該物種及其相應的測序樣品進行可變剪切事件的分類及統(tǒng)計。
