血腦屏障是指腦毛細(xì)血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成的血漿與腦細(xì)胞之間的屏障和由脈絡(luò)叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障，這些屏障能夠阻止某些物質(zhì)(多半是有害的)由血液進(jìn)入腦組織。血腦屏障可使腦組織少受甚至不受循環(huán)血液中有害物質(zhì)的損害，從而保持腦組織內(nèi)環(huán)境的基本穩(wěn)定，對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生物學(xué)意義。
采用永生化細(xì)胞系建立的BBB模型應(yīng)運(yùn)而生，較為常用的永生化內(nèi)皮細(xì)胞系如小鼠bEnd3和bEnd5，豬PBMEC/C1-2和人hCMEC/D3，以及非腦細(xì)胞系如CaCo-2，MDCK-MDR1，Huvecs和ECV304等。
評(píng)價(jià)體外模型成功與否的指標(biāo)，主要基于體外模型的滲透性以及內(nèi)皮細(xì)胞特定酶類(lèi)的表達(dá)、緊密連接的形成。
1. Transwell預(yù)處理：移液器吸取2%明膠溶液100μl，放入Transwell上室中，浸潤(rùn)PET膜，置于37℃，5%CO2細(xì)胞孵箱靜置30min，進(jìn)行包被，用移液器吸出棄去明膠溶液，備用。
2. 體外BBB模型建立：當(dāng)T25培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)密度大于 80-90%，進(jìn)行細(xì)胞傳代。棄去培養(yǎng)基，加入1ml PBS 緩慢沖洗培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞，重復(fù)3次。
3. 加入1ml 0.25%胰酶，完全浸潤(rùn)細(xì)胞表面，放置 37℃細(xì)胞孵箱中靜置消化 3-5min，在電子顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)變圓回縮后，雙手輕輕拍打培養(yǎng)瓶使絕大部分細(xì)胞脫落，快速加入 5ml 細(xì)胞完全培養(yǎng)基終止消化。
4. 使用移液器將 T25 培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液吸出至 15ml 的離心管中，離心，1000rpm，5min。使用移液器將離心管中上清液吸出棄去，加入細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
5. 將細(xì)胞接種于包被了 2%明膠的 Transwell 小室上室的 PET 膜上，加至 250ul Huvecs 細(xì)胞完全培養(yǎng)基。將 C6 細(xì)胞接種于 24 孔 Transwell 小室的下室，加入 C6 完全培養(yǎng)基至 1000ul，保持 Transwell 小室上下室之間液面相平。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、單細(xì)胞組及空白對(duì)照組。
6. 每天換液并定時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。大約 6-8 天觀察細(xì)胞基本融合后，進(jìn)行體外 BBB 模型評(píng)價(jià)的系列實(shí)驗(yàn)。
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